การเจาะหลังมีขั้นตอนการทำโดยเริ่มจากการจัดท่าผู้ป่วย ส่วนใหญ่จัดในท่านอนตะแคง ให้ยาชาเฉพาะที่ ใส่เข็มเข้าไปยังช่องใต้เยื่อดูราเพื่อเก็บน้ำหล่อสมองไขสันหลัง เมื่อเข้าถึงจุดนี้แล้วจะมีการวัดความดันเปิดของน้ำหล่อสมองไขสันหลังโดยใช้แมนอมิเตอร์ ค่าปกติของความดันจะอยู่ที่ 6 ถึง 18 เซนติเมตรน้ำ ความดันนี้มักพบว่าสูงกว่าปกติในผู้ป่วยเยื่อหุ้มสมองอักเสบจากเชื้อแบคทีเรีย ลักษณะของของเหลวที่เห็นอาจพอบอกโรคได้ โดยน้ำที่ขุ่นแสดงว่ามีระดับโปรตีน เม็ดเลือดขาว เม็ดเลือดแดง และ/หรือแบคทีเรียสูง จึงชี้ว่าน่าจะเป็นเยื่อหุ้มสมองอักเสบจากแบคทีเรีย
ตัวอย่างน้ำหล่อสมองไขสันหลังจะได้รับการตรวจหาและระบุชนิดของเม็ดเลือดขาว เม็ดเลือดแดง ระดับโปรตีนและระดับน้ำตาล การนำไปย้อมสีกรัมอาจทำให้เห็นเชื้อแบคทีเรียซึ่งเป็นสาเหตุของเยื่อหุ้มสมองอักเสบจากเชื้อแบคทีเรียได้ แต่ถึงจะตรวจไม่พบเชื้อก็ไม่สามารถบอกได้ว่าไม่ใช่เยื่อหุ้มสมองอักเสบจากเชื้อแบคทีเรีย เนื่องจากจะสามารถตรวจพบเชื้อจากการย้อมสีกรัมได้เพียง 60% ของผู้ป่วยเท่านั้น นอกจากนี้ยังจะลดลงเหลือ 20% อีกด้วย หากผู้ป่วยได้รับยาปฏฺชีวนะก่อนที่จะเก็บตัวอย่างน้ำหล่อสมองไขสันหลัง นอกจากนี้การย้อมสีกรัมยังมีความน่าเชื่อถือน้อยในการติดเชื้อบางชนิด เช่น โรคติดเชื้อลิสเทอเรีย การนำตัวอย่างน้ำไปเพาะเชื้อนั้นมีความไวสูงกว่า และสามารถระบุชนิดของเชื้อก่อโรคได้ถึง 70-85% ของผู้ป่วย แต่ใช้เวลานานถึงประมาณ 48 ชั่วโมงจึงจะได้ผล ชนิดของเม็ดเลือดขาวที่พบเด่นสามารถบ่งบอกถึงสาเหตุได้คร่าวๆ ว่าเกิดจากการติดเชื้อแบคทีเรีย (ส่วนใหญ่เป็นนิวโทรฟิลเด่น) หรือไวรัส (ส่วนใหญ่เป็นลิมโฟซัยต์เด่น) ถึงแม้จะไม่เป็นตัวบ่งชี้ที่ชัดเจนในช่วงแรกของการดำเนินโรคก็ตาม นอกจากนี้หากพบมีอิโอซิโนฟิลเด่นยังบ่งชี้ว่าน่าจะมีสาเหตุมาจากปรสิตหรือเชื้อรา และอื่นๆ ได้ ถึงแม้จะพบค่อนข้างน้อยก็ตาม
ค่าปกติของความเข้มข้นของกลูโคสในน้ำหล่อสมองไขสันหลังอยู่ที่มากกว่า 40% ของความเข้มข้นในเลือด ค่านี้มักต่ำลงในผู้ป่วยเยื่อหุ้มสมองอักเสบจากแบคทีเรีย ดังนั้นหากนำค่าความเข้มข้นของกลูโคสในน้ำหล่อสมองไขสันหลังหารด้วยความเข้มข้นของกลูโคสในเลือดแล้วมีสัดส่วนน้อยกว่า 0.4 จึงเป็นการบ่งชี้ว่ามีเยื่อหุ้มสมองอักเสบจากแบคทีเรีย สำหรับในทารกแรกเกิด ค่าปกติของระดับกลูโคสในน้ำหล่อสมองไขสันหลังจะสูงกว่านี้ จึงต้องใช้เกณฑ์ตัดที่ 0.6 (60%) ซึ่งถ้าต่ำกว่าสัดส่วนนี้จึงจะถือว่าผิดปกติ การมีระดับของแลคเตตในน้ำหล่อสมองไขสันหลังที่สูงช่วยบ่งว่าน่าจะเป็นเยื่อหุ้มสมองอักเสบจากแบคทีเรีย เช่นเดียวกันกับการมีจำนวนเม็ดเลือดขาวสูง
มีการตรวจพิเศษมากมายที่ถูกออกแบบมาเพื่อแยกชนิดต่างๆ ของเยื่อหุ้มสมองอักเสบ การทดสอบการตกตะกอนของลาเท็กซ์อาจให้ผลเป็นบวกได้ในการติดเชื้อ Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Escherichia coli และเสตร็ปโตคอคคัสกลุ่ม B ส่วนใหญ่ไม่แนะนำให้ใช้ตรวจเป็นประจำเนื่องจากน้อยครั้งที่จะเปลี่ยนแปลงวิธีการรักษา แต่อาจมีที่ใช้ในกรณีที่ตรวจด้วยวิธีอื่นแล้วไม่สามารถให้การวินิจฉัยได้ เช่นเดียวกัน การทดสอบด้วยลิมิวลัสไลเซทการให้ผลบวกได้ในกรณีที่เยื่อหุ้มสมองอักเสบนั้นเกิดจากเชื้อแบคทีเรียกรัมลบ แต่การนำมาใช้ยังมีข้อจำกัดเว้นแต่ว่าการตรวจอื่นๆ ไม่ให้ผลตรวจที่ช่วยในการวินิจฉัย การตรวจด้วยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) สามารถเพิ่มจำนวนดีเอ็นเอของเชื้อก่อโรคปริมาณน้อยๆ ได้ ทำให้สามารถตรวจพบดีเอ็นเอของแบคทีเรียหรือไวรัสในน้ำหล่อสมองไขสันหลังได้ เป็นการตรวจที่มีความไวและความจำเพาะสูงมากเนื่องจากใช้ปริมาณดีเอ็นเอของเชื้อก่อโรคเพียงเล็กน้อยเท่านั้น อาจสามารถระบุเชื้อแบคทีเรียก่อโรคได้ในเยื่อหุ้มสมองอักเสบจากแบคทีเรีย และอาจแยกเชื้อก่อโรคของเยื่อหุ้มสมองอักเสบจากเชื้อไวรัสได้หลายๆ ชนิด (เช่น เอนเทอโรไวรัส, เฮอร์ปีส์ซิมเพล็กซ์ไวรัส 2 และคางทูมในผู้ป่วยที่ไม่ได้รับการฉีดวัคซีน) การตรวจทางวิทยาภูมิคุ้มกันเพื่อตรวจหาแอนติบอดีต่อไวรัสอาจมีประโยชน์ในเยื่อหุ้มสมองอักเสบจากเชื้อไวรัส หากสงสัยเยื่อหุ้มสมองอักเสบจากวัณโรคจะมีการนำตัวอย่างไปย้อมด้วยสีซีห์ล-นีลเซนซึ่งมีความไวต่ำ และส่งเพาะเชื้อวัณโรคซึ่งใช้เวลานาน นอกจากนี้ยังมีการตรวจ PCR ซึ่งมีการนำมาใช้มากขึ้น การวินิจฉัยเยื่อหุ้มสมองอักเสบจากเชื้อราคริปโตคอคคัสสามารถทำได้โดยใช้หมึกดำย้อมน้ำหล่อสมองไขสนหลัง อย่างไรก็ดีปัจจุบันมีการตรวจหาแอนติเจนของเชื้อราคริปโตคอคคัสในเลือดหรือน้ำหล่อสมองไขสันหลังที่มีความไวดีกว่าใช้ทั่วไป
สิ่งหนึ่งที่ยังคงเป็นปัญหาในการวินิจฉัยและการรักษาคือเยื่อหุ้มสมองอักเสบที่ได้รับการรักษามาแล้วบางส่วน ผู้ป่วยอาจเริ่มมีอาการของเยื่อหุ้มสมองอักเสบหลังจากได้รับยาปฏิชีวนะมาแล้ว (เช่นได้รับการรักษาเป็นโพรงอากาศอักเสบมาก่อน) เมื่อเกิดกรณีเช่นนี้ ผลตรวจน้ำหล่อสมองไขสันหลังอาจเหมือนเยื่อหุ้มสมองอักเสบจากเชื้อไวรัส แต่ยังคงจำเป็นต้องให้ยาปฏิชีวนะเพื่อรักษาเชื้อแบคทีเรียไปก่อนจนกว่าจะมีหลักฐานยืนยันว่าเป็นการติดเชื้อไวรัส (เช่น ตรวจพบดีเอ็นเอของเอนเทอโรไวรัสจากการทำ PCR)
